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細胞色素C一些使用情況分析簡述報告

更新時間:2018-02-06      點擊次數:3038
   細胞色素C 是以一種鐵卟啉為輔基的呼吸酶,廣泛存在于所有的需氧組織中。在心肌與其他做劇烈運動的肌肉中含量zui為豐富。細胞色素C 位于線粒體的蛋白質—脂質絡合物中,分子量約為13000,肽鏈中含有19個賴氨酸殘基,為一堿性蛋白, 等電點(10.5~10.8)高、易溶于酸性溶液, 故采用酸化水提取。人造沸石為鋁酸鈉,它是一種陽離子交換劑,細胞色素C 分子剛好進入它的表面空隙。在pH7.5時細胞色素C 呈正電荷,它可與沸石分子上的鈉離子發生交換,從而被沸石吸附。裝入層析柱后,用25%硫酸銨洗脫,又可將細胞色素C 交換下來。硫酸銨主要是降低沸石對細胞色素C 的親和力。硫酸銨鹽析可明顯提高細胞色素C 純度,主要為去除雜蛋白。另外三氯乙酸可引起細胞色素C 變性和聚合,必須嚴格控制三氯乙酸用量。
  細胞色素C與材料試劑
  1、 設備:組織搗碎機、酸度計、離心機、分光光度計、層析柱、透析袋、磁力攪拌器、冰箱。
  2、 儀器:剪刀、燒杯、漏斗、濾紙、天平、玻璃棒、紗布、試管、膠頭滴管。
  3、 試劑:聯二亞硫酸鈉、硫酸、硫酸銨、三氯乙酸、人造沸石、氯化鋇、氯化鈉、氫氧化銨。
  4、 材料:新鮮豬心(2個)。
  細胞色素C實驗步驟
  1、預處理:健康豬心去脂肪等結締組織—→剪碎放入碎冰中(保護酶的活性,避免搗碎機破碎時使酶失活)—→放入生理鹽水中清洗去污—→稱重:燒杯80g ,燒杯+豬心=240g,(240-80)×1.5=240ml酸化水—→組織搗碎機勻漿10min (勻漿3min ,停5min ,為了保證搗碎機安全)
  2、提取:攪拌后靜置2h —→四層紗布過濾后加入1.5倍酸化水于沉淀物中,在過濾后靜置2h —→放入冰箱保存過夜—→從冰箱中取出—→加2mol/L氨水調PH 至6.0,靜置30min ,過濾—→濾液加2mol/L氨水調PH 至7.5,靜置30min, 過濾
  3、吸附:加10%人造沸石(濾液為220ml )—→磁力攪拌器攪拌吸附1h —→蒸餾水洗3次—→0.2%NaCI 溶液洗3次—→濾出人造沸石待用
  4、洗脫:在柱中裝人造沸石體積的三分之二蒸餾水—→將沸石放入柱中—→裝滿25%硫酸銨溶液進行洗脫,流速控制在2ml/min 以下, 收集紅色的洗脫液(沒分辨出紅色液體階段,收集了所有洗脫液)
  5、鹽析:在洗脫液(300ml )中慢慢加入固體硫酸銨75g, 邊加邊攪拌,使硫酸銨溶液的濃度為50%—→置4℃冰箱過夜—→過濾,收集濾液—→向過濾液中按22ml/L的量滴加濃度為20%的三氯乙酸溶液(過濾液和20%三氯乙酸溶液在4℃遇冷, 邊加邊攪拌, 加時要快, 防止局部蛋白質變性)—→加完后分成8管,立即離心—→無明顯沉淀,再5000轉離心15min —→無明顯沉淀,向每只離心管加入2滴濃度為20%的三氯乙酸溶液—→再5000轉離心15min —→無明顯沉淀,實驗結束
  6、透析 將上述溶解后的細胞色素C 裝入透析袋中, 放進500ml 燒杯中(用磁力攪拌器攪拌),用去離子水透析, 除去硫酸根離子,15min 換水一次,換手3~4次后,檢查硫酸根離子是否已被除盡。檢查方法:取2ml 氯化鋇溶液加入試管中,滴加2~3滴透析外液至試管中,若出現白色沉淀,表示硫酸根離子未除盡,如果不出現沉淀,表示透析*。將透析液過濾, 收集濾液即為細胞色素C 粗品。 記錄此粗品的體積。
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